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GoldStar Best DNA Polymerase說明書

(5×GoldStar Best PCR Buffer With Mg  )2+

目錄號：K0654

保存條件：-20℃保存。

組分說明

  Cat. No.                                 K0654      K0654A      K0654C

  Kit Size                                  250 U        500 U       6×500 U

  GoldStar Best DNA Polymerase, 5 U/μl       50 μl       100 μl      6×100 μl

  5×GoldStar Best PCR Buffer                 1 ml       2×1 ml        3×5 ml

             注意：本產品的5×GoldStar Best PCR  Buffer中含有7.5mM鎂離子。

產品簡介

　　該產品是經過特殊處理的熱啟動高保真聚合酶。該聚合酶具有  5′-3′DNA聚合酶活

性，5′-3′核酸外切酶活性和3′-5′核酸外切酶活性，在普通PCR條件下，與GoldStar Taq

DNA Polymerase相比，具有擴增效率高、錯配率低的優良性能?；瘜W修飾使該酶在常

溫下沒有聚合酶活性，有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結合或引物二聚

體而產生的非特異性擴增，酶的激活須在 95℃下孵育10分鐘，該條件可以整合入已有

的PCR熱循環程序。優化的緩沖體系使酶的作用發揮最大功效，實現對目的片段的高

保真、高特異性、高擴增效率、高靈敏度擴增。使用本制品擴增得到的   PCR產物的3′

端附有一個“A"堿基，因此可直接用于T/A克隆。本產品應用于常規的PCR、RT-PCR和

多重PCR，特別適用于對特異性、保真性和擴增效率均有較高要求的PCR。

活性定義

　　用活性化的大馬哈魚精ziDNA作為模板/引物，在74℃，30分鐘內，將10   nmol脫

氧核苷酸摻入到酸性不溶物質所需的酶量定義為1個活性單位（U）。

質量控制

　　經過多次柱純化， SDS-PAGE檢測其純度大于99%；經檢測無外源核酸酶活性；

PCR方法檢測無宿主殘余DNA；能有效地擴增人基因組中的單拷貝基因；室溫存放一

個月，無明顯活性改變。

                本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途

使用方法

    以下舉例為常規PCR反應體系和反應條件，實際操作中應根據模板、引物結構和目的

    片段大小不同進行相應的改進和優化。

    1. PCR反應體系

試劑                                     50 μl反應體系        終濃度

5×GoldStar Best Taq PCR Buffer                10 μl                1×

dNTP Mix，2.5 mM each                       4 μl            200 μM each

Forward Primer，10 μM                      2 μl            0.4 μM

Reverse Primer，10 μM                       2 μl            0.4 μM

Template DNA                                <1 μg         <1 μg/reaction

GoldStar Best Taq DNA Polymerase，5 U/μl      0.5 μl

RNase-Free Water                             up to 50 μl

       注意：1）引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優化反應體系。

       2）鎂離子濃度請以終濃度1.5-3 mM作為設定范圍的參考。本產品的5×GoldStar Best Taq PCR Buffer中已含有7.5 mM鎂離子，可根據不同引物對和模板調節鎂離子濃度，由此優化反應體系。

    2. PCR反應條件

步驟                 溫度              時間

預變性               95℃             10 min

變性                 94℃             30 s

退火                55-65℃           30 s     30-40個循環

延伸                 72℃             60 s

終延伸               72℃             5 min

       注意：1）一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優化反應條件。

       2）延伸時間應根據所擴增片段大小設定，本產品中所包含的GoldStar Best DNA Polymerase的擴增效率為1 kb/min。

       3）可根據擴增產物的下游應用設定循環數。如果循環次數太少，擴增量不足；如果循環次數太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以在保證產物得率的前提下應盡量減少循環次數。

       4）本產品須在預變性95℃，10 min條件下實現酶的活化。

    3.結果檢測：反應結束后取5  µl反應產物，加入適量上樣緩沖液后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

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