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樣品濃縮技術(shù)

在免疫酶技術(shù)中，有時需要將樣品液（如抗原、抗體、酶、酶標抗體或酶標抗原）濃縮。

常用的濃縮技術(shù)如下：

1.反透析法

如果在裝有樣品液的透析袋周圍放上濃度很高的且具有吸水作用的多聚物或蔗糖，由于膜內(nèi)滲透壓比膜外低，膜內(nèi)樣品液中的蛋白質(zhì)進行濃縮。常用的多聚物有聚乙烯吡咯酮（Polyvinylpyrrolidone,簡稱PVP，分子量約12000）、聚乙二醇（Polyethylene glycol,簡稱PEG,亦稱Carbowax,分子量約6000，但PEG的分子量在5000－10000均可用），吸水劑不一定用干劑，可用30%的濃溶液，吸水更快。PEG濃溶液中常加入堿液以中和酸性。吸水劑用后可通過加溫或吹風(fēng)進行回收。PVP和PEG濃縮效果好，但是，小分子量聚合體易進入膜內(nèi)，并且PVP對在280nm波長處的紫外光有吸收作用。由于蔗糖易進入膜內(nèi)，因此，要求蔗糖必須高純度，并且對下一步工作（例如免疫動物）無影響。蔗糖的優(yōu)點是來源方便，但會因分子量小而影響濃縮效果。

   2.凝膠吸水法

   凝膠例如葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠是具有一定孔徑的微孔和吸水性能的多聚物顆粒，在蛋白樣品液中加入孔徑較小的凝膠顆粒，能吸去樣品中的水分，達到濃縮的目的。一般用Sephadex G25 或G50,濃縮效果好，吸附作用也小，經(jīng)過離心去吸水凝膠即得蛋白濃縮液。

3.蒸發(fā)去水法

將樣品液裝在透析袋內(nèi)，懸掛起來，在低溫下用電扇吹風(fēng)蒸發(fā)，或?qū)悠芬旱乖谄矫嫣麓蓽\盆中，用電扇吹風(fēng)蒸發(fā)，均可達到濃縮目的。此方法簡便，但是所需時間較長，并會增高樣品中的鹽濃度。因此，在濃縮前或濃縮過程中應(yīng)對揮發(fā)性緩沖液進行透析，然后再用蒸發(fā)去水法濃縮。

4.冰凍法

樣品液在冰凍時，水分子結(jié)成冰，鹽類及蛋白分子不進入冰內(nèi)而留在液相中。操作時先將樣品液冷卻成固態(tài)，然后緩緩融解，利用溶劑與溶質(zhì)融解點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。例如，酶的濃縮，通過冰凍形成不含酶的純冰結(jié)晶浮于液面，酶集中于下層溶液中，移去上層冰塊，即得酶的濃縮液。

5.超濾濃縮法

在濃縮樣品時，超濾法的作用也很大，它可以在3－4h內(nèi)，將500ml很稀的樣品液濃縮300倍以上，而不使蛋白變性，回收率高達90%以上。

超濾濃縮法是借助一種特殊的薄膜，對樣品液中各種溶質(zhì)分子進行選擇性過濾的方法。當樣品液在一定的壓力通過特殊薄膜時，溶劑和小分子通過，大分子因受薄膜阻留而留在原樣品液中，這是一項新興的濃縮、去鹽和生物大分子分離純化的技術(shù)。（上海研謹）